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RNA速率（RNA velocity）是单细胞转录组研究中非常经典的分析手段，通过统计细胞内剪接与未剪接mRNA的比例，推断细胞分化方向、细胞状态转变轨迹，挖掘细胞拟时间动态演化过程。传统本地执行RNA‑velocity分析需要处理BAM文件、生成loom文件、完成数据整合与可视化，代码链路长，对使用者R语言编程能力有一定门槛。本文介绍HiOmics RNA速率分步在线工具，上传对应文件即可完成全套分析与绘图输出。

整套工具拆分为Step1‑Step5共5个功能模块，模块之间上下游输入输出严格衔接，样本数为1个的时候可以跳过Step3样本合并步骤。

Step1：单细胞转录组RNA速率分析step1，Seurat对象数据预处理

工具地址：https://www.henbio.com/tooldetail?id=487

本步骤主要用于数据准备，输入文件为已经完成细胞类型注释的Seurat RDS文件。工具会自动提取barcode标签、细胞坐标、metadata、表达矩阵，统一校正barcode标签，保证和前面细胞分群、细胞类型注释上游分析的标签完全匹配。

1. 上传经过细胞注释的Seuratproject rds文件，运行；

2. 在项目结果下载`coordinate_result tar`压缩包。解压后得到文件夹`coordinate_result`，内部包含barcodes、counts矩阵、基因列表、metadata、PCA、UMAP坐标等一系列中间表格文件，作为Step4的输入数据目录。

Step2：单细胞转录组RNA速率分析step2，BAM文件转换生成loom文件

工具地址：https://www.henbio.com/tooldetail?id=488

该步骤接收Cell Ranger输出的BAM文件，完成bam文件处理，输出每个样本对应的loom文件，是RNA速率分析的核心上游步骤。

1. 新建文件夹，把样本对应的排序bam文件、barcodes.tsv文件放到同一个文件夹内，作为BAM文件目录上传；

2. 选择对应的物种名称（例如Homo sapiens和Mus musculus）；

3. 提交运行，下载结果压缩包，解压得到单样本loom文件。

每一个样本，都需要单独跑一次step2，每个样本各自生成一份loom文件。

Step3：单细胞转录组RNA速率分析step3，多样本loom文件合并

工具地址：https://www.henbio.com/tooldetail?id=494

只有≥2个样本才需要运行本步骤；单样本直接跳过，使用step2输出loom进入step4。

1. 将step2输出的全部样本loom文件，统一放到同一个文件夹；

2. 将该文件夹作为loom文件目录上传；

3. 运行任务，下载得到合并后的`uterus loom`文件，用于下一步速率计算。

Step4：单细胞转录组RNA速率分析step4，RNA速率计算与全局可视化

工具地址：https://www.henbio.com/tooldetail?id=495

Step4完成RNA velocity核心计算，输出细胞分化矢量图、置信度、速率基因列表等全套图表结果。

需要两类输入：

1.Step1解压完成的`coordinate_result`文件夹，作为数据目录；

2.Step3输出合并后的uterus loom（单样本直接填step2得到loom文件）；

3. 填写样本名映射表格：第一列填写loom文件名称，第二列填写自定义样本名称，样本名必须和上游Seurat对象metadata样本命名保持一致。

提交运行后，输出结果包含：UMAP速率矢量图、细胞类型占比PDF、速率置信度PDF、高速率基因列表csv，以及h5ad格式中间文件`adata_ldata_last h5ad`。该h5ad文件是Step5的输入文件。

Step5：单细胞转录组RNA速率分析step5，目标基因速率可视化（可选）

工具地址：https://www.henbio.com/tooldetail?id=496

本步骤属于可选分析，用于针对性查看自己关注的基因的RNA速率分布，输出基因spliced‑unspliced散点图、基因表达空间分布图。

1. 上传step4输出的`adata_ldata_last h5ad`；

2. 在基因表格填入需要关注的基因名，例如KRT19、SOX9、EPCAM；

3. 设置分组列名，一般填celltype，按照细胞类型分组展示结果；

4. 运行后输出`genes_expression_pdf`，得到各个目标基因的速率可视化结果，可直接用于论文配图。

实操关键注意事项

1. 全流程所有上传文件、文件夹名称禁止中文、空格、特殊符号，否则会直接报错；

2. 文件上下游强依赖：Step1来自注释完毕的Seurat对象，Step2来自CellRanger输出bam，上下游barcode必须完全对齐；

3. 单样本直接跳过Step3，不要强行运行合并模块；

4. 每一步任务结束后，务必下载保存结果压缩包，后续步骤需要使用解压之后的文件。

总结

这套分步式RNA速率在线工具，把原本需要多步代码、多个软件协作的复杂流程网页化。研究者只需要准备好Cell Ranger输出结果与注释完成的Seurat对象，按照step1‑step5顺序执行，即可完成RNA速率计算、分化轨迹绘图、目标基因速率可视化，降低了单细胞拟时序动态研究的分析门槛，输出的图表和表格可以直接用于后续论文撰写。