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摘要：本文基于RoosterBio官方公开数据、同行评审文献、会议研究资料及行业报道，系统梳理其在2D/3D工艺可比性、多供体一致性、规模放大一致性及MSC-EV工艺一致性方面的科学逻辑、关键证据与产业应用思路。重点分析群体倍增水平PDL、群体倍增时间PDT以及细胞身份、分化、IDO和分泌谱等质量属性在MSC规模化中的作用，并介绍0.1 L微载体培养、15 L与50 L规模相关研究及其适用范围。

关键词：间充质干细胞、间充质基质细胞、MSC规模化培养、批间一致性、2D/3D可比性、群体倍增水平、产品漂移、生物反应器放大、MSC-EV、群体倍增时间、PDL、关键质量属性

MSC（间充质基质/干细胞）从研发走向商业化制造时，规模化放大可能引入的产品漂移（Product Drift）是需要重点控制的风险之一。RoosterBio相关公开研究以累计群体倍增水平（PDL）作为工艺比较的重要参考，在2D贴壁培养与3D微载体生物反应器之间分析关键质量属性（CQA）的可比性，并进一步通过多供体及不同规模的研究数据评价工艺稳健性。

对于MSC制造而言，最终目标并不是简单证明三维生物反应器比二维培养瓶获得了更多细胞，而是要在扩大培养规模以后，确认所获得的细胞是否仍然具有预期的身份、功能和其他质量特征。因此，“PDL一致”是一种用于提高研究可比性的工艺设计思路，但不能替代后续对CQA的实际检测。

一、引言：规模化放大中的“产品漂移”困局

1.1 行业共识：规模化不等于风险同比例放大

2026年9月10日，Cell & Gene Live举办了《Scaling Next-Gen MSC Therapies Without Scaling Risk》网络研讨会，邀请来自Mesoblast、MEDIPOST和Kiji Therapeutics的产业研究人员，讨论MSC制造过程中规模化、供体差异、效力和产品可比性等问题。

讨论强调，细胞治疗制造不仅需要增加最终细胞数量，还需要保持与目标产品功能有关的关键质量属性。对于活细胞产品而言，制造过程与最终产品本身密切相关，工艺变化可能影响细胞状态，因此需要对制造变更前后的产品进行相应比较。

无论采用2D细胞工厂、3D微载体生物反应器、垂直轮、固定床还是其他培养系统，实际开发中都需要回答一个问题：当生产规模和培养模式发生变化以后，如何证明新的制造工艺仍然能够获得与预期细胞产品具有可比性的结果。

Mesoblast的Ryoncil是MSC产品产业化和监管发展中的重要案例，该产品于2024年12月18日获得美国FDA批准，适应证为符合规定年龄范围的儿童激素难治性急性移植物抗宿主病。其此前研发和审评过程中曾经历完整回复函（Complete Response Letter，CRL）等监管沟通，相关讨论涉及临床和CMC等多方面问题。

因此，Ryoncil的案例提示细胞治疗开发者，制造变更和产品效力之间的关系值得尽早关注，但不能把具体产品的审评历程简单归因于某一种单独工艺参数，也不能认为其他MSC产品已经自动获得相同监管结论。

1.2 漂移的三类来源：工艺、供体、规模

MSC规模化放大中的产品漂移，可以从工艺、供体和规模三个方向分析。工艺漂移主要来自培养方式或相关操作变化；供体差异主要来自起始细胞的天然生物学差异；规模漂移则与不同反应器环境之间的变化有关。这三类变量可能同时出现，因此需要通过过程数据和细胞质量结果进行区分。

工艺漂移可能发生在培养模式切换、原材料变化及不同培养操作之间。例如从二维培养瓶改为三维微载体培养以后，细胞接触的培养基质、剪切环境和收获方法均可能改变，进而影响MSC表面标志物、分化或相关功能指标。

供体变异主要表现为不同供体细胞的生长速度、最终密度和扩增倍数不同。由于MSC具有生物来源差异，即使使用统一培养基和反应器，也不一定获得完全相同的细胞产量。

规模漂移则主要涉及不同反应器尺寸和设备构型的变化。随着生产体积增加，混合、剪切、传质及DO/pH微环境可能发生改变，因此不能简单将小规模培养条件按体积比例放大，而需要进一步开展相关工艺研究。

1.3 RoosterBio的回答：以“细胞年龄”作为可比性的锚点

RoosterBio相关2D和3D可比性研究提出，应当将细胞累计群体倍增水平PDL作为工艺比较的重要参考，而不是仅仅根据最终细胞数量或某一培养阶段的扩增倍数判断。

在相近PDL水平下比较不同培养模式获得的MSC，可以减少累计扩增历史不同带来的部分影响，进一步观察两组细胞的身份、分化、免疫调节和分泌谱等质量属性。

这种方法的意义，是为2D与3D培养结果建立一个更具有可解释性的共同参照。但相同PDL本身并不代表细胞在生物学意义上完全相同，仍然需要通过对应CQA分析验证。

二、2D vs 3D可比性：科学前提、数据与设计逻辑

2.1 为什么是PDL

PDL（Population Doubling Level，群体倍增水平）用于描述细胞群体累计经历的扩增程度，可作为MSC细胞培养历史的重要指标。与简单比较最终细胞数量相比，PDL能够进一步反映细胞从起始细胞库进入后续培养以后所经历的累计倍增过程。

在MSC工艺研究中，不同供体最终细胞密度可能存在明显差异，例如公开资料涉及0.2×10⁶至0.7×10⁶ cells/mL的范围。即使这些供体采用相同培养体系，最终细胞数量也不一定完全一致。因此，将细胞累计PDL与最终密度结合分析，比只使用细胞产量更有助于理解不同供体之间的差异。

同一供体细胞在二维和三维培养体系中的最终密度也可能不同。如果在相近PDL水平下观察到CQA具有相近表现，可以为两种培养模式之间的可比性提供证据之一，但仍然需要分析具体质量属性。

RoosterBio相关工艺资料同时关注PDL和PDT。PDL描述累计扩增程度，而PDT（Population Doubling Time，群体倍增时间）描述生长速度。原稿提出以相近PDL终点和PDT作为2D与3D工艺的比较目标，其中部分研究的PDT约为24小时。

需要注意，PDT可能受到供体、培养基、接种密度和培养环境影响，因此“PDT不随培养模式改变”应当理解为特定研究条件下需要验证的结果，而不是所有MSC培养体系都天然成立的普遍规律。

2.2 直接证据链：公开研究的三重佐证

证据一：hUC-MSC，0.1 L/15 L反应器与2D培养的比较。

Adlerz K等人在2020年《Cytotherapy》会议增刊中发表了关于无异种动物源成分条件下脐带来源MSC生物反应器培养的研究摘要。该研究关注如何在可规模化生物反应器中获得细胞，并使其与二维培养所得细胞在相近累计PDL及相关关键质量属性方面保持可比较性。

相关比较维度包括最终PDL、生长速率、CD90和CD166等阳性表面标志物、CD34和CD45等阴性标志物、骨/脂/软骨相关分化潜能、IDO诱导的免疫调节能力，以及VEGF、IL-8、bFGF、HGF、TIMP1和TIMP2等分泌因子。

该来源属于会议摘要，能够为研究方向和部分结果提供参考，但在引用时应与完整研究论文区分。

证据二：ISCT 2019会议海报及相关技术资料。

RoosterBio团队在2019年ISCT相关研究中，介绍了二维培养瓶与三维生物反应器之间的可比性评价，涉及细胞生长速率、PDL、流式标志物、多系分化、血管生成相关因子分泌及可诱导免疫调节功能等多个方面。

这类研究资料说明，2D/3D可比性评价需要同时考虑细胞身份和功能，而不是只将细胞密度或扩增倍数作为唯一比较终点。

证据三：2020年《Bioengineering》微载体培养研究。

Lembong J等人在2020年发表的《Bioreactor Parameters for Microcarrier-Based Human MSC Expansion under Xeno-Free Conditions in a Vertical-Wheel System》中，建立了无异种动物源成分条件下的MSC微载体补料分批培养体系。

研究在5天培养周期中获得约2×10⁵–6×10⁵ cells/mL的细胞密度，最终PDL维持在16–20范围，并使用多个MSC供体评价培养工艺的稳健性及细胞相关表型和功能特征。

研究还分析了收获后细胞的继续扩增能力，为理解三维培养细胞的后续状态提供补充信息。

需要注意，这三个证据来源包括会议摘要、会议相关技术资料和完整研究论文，证据形式并不完全相同，因此不能将其简单描述为三篇完全独立的完整临床效力验证研究。

2.3 工艺设计原则的工程化落地

RoosterBio相关研究将PDL和PDT等指标进一步转化为可记录的培养参数，原稿引用Bioengineering 2020相关研究整理了二维和三维培养的接种密度、倍增时间、传代定义及最终PDL终点。

需要明确，二维培养使用cells/cm²表示细胞接种密度，而三维培养还使用cells/mL及等效微载体面积相关指标，两者不能直接比较数值大小。

同时，原表中的“一代”主要指细胞经过一次消化和传代操作时，代次编号增加，并不等同于通过细胞数量变化获得的群体倍增水平。实际研究中，应当同时保留传代次数和累计PDL等信息。

最终PDL作为两种培养方式的共同参考，有助于提高比较合理性，但仍然需要结合实际CQA结果判断工艺可比性。

三、批间一致性数据：跨规模、跨供体的多维验证

3.1 多供体验证：工艺对donor差异的容忍度

MSC工艺稳健性的重要评价内容之一，是同一套培养方案能否在不同供体细胞中获得具有参考价值的重复结果。由于供体之间存在天然生物学差异，即使培养基和反应器条件相同，最终扩增倍数和细胞密度也可能不同，因此多供体评价应同时分析产量和细胞质量。

RoosterBio相关0.1 L垂直轮生物反应器研究报告，在多个MSC供体的培养中，所优化微载体工艺能够在约5天内获得2–6×10⁵ cells/mL的细胞密度，最终PDL处于16–20范围，并保持相应的细胞表型和功能特征。

不同供体之间的扩增能力和最终细胞密度仍然具有差异。原稿相关公开资料还提到，在所研究供体范围内可以观察到约0.2–0.7×10⁶ cells/mL的最终密度变化，因此并不需要把所有供体培养的最终产量理解为完全一致。

相关研究还涉及表面标志物、三系分化、IDO和细胞因子分泌等CQA分析，用于进一步判断不同供体细胞在经过相应扩增工艺后，是否保持预期的细胞属性。

但这些结果只能说明所测试供体和培养条件下获得了相应数据，不能据此推断任何未来供体都不会出现质量差异。实际产品制造仍需根据自身供体范围和目标CQA建立相应评价方法。

3.2 规模放大一致性：0.1 L、0.25 L、15 L与50 L相关研究

RoosterBio公开资料中除了0.1 L垂直轮微载体培养研究，也介绍了与Sartorius合作的Ambr250和Biostat STR相关MSC规模化研究。

其中，Ambr250为约0.25 L规模的小型工艺研究平台，可用于较小规模的参数比较和放大相关分析；Biostat STR则被用于15 L和50 L等更大工作体积的研究。

RoosterBio公开技术案例报告，相关50 L规模开展了两次独立运行，单批均获得超过2.5×10¹⁰个MSC，即超过250亿个细胞。相关资料还报告，Ambr250与更大规模培养体系在特定培养周期和最终细胞密度方面呈现相近的扩增动力学。

这些结果说明，在相应细胞来源、培养基和设备条件下，相关工艺能够实现从小规模开发到较大规模培养的技术转移。

不过，需要区分不同研究中的设备体系。0.1 L垂直轮工艺与Ambr250及Biostat STR搅拌罐工艺并不是完全相同的反应器设计，因此不能把它们直接写成一条已完整验证全部参数的连续放大流程。每一种设备转换仍需针对剪切、传质及细胞CQA等变量开展实际研究。

四、技术架构：支撑批间一致性的培养基与设备体系

4.1 培养基体系：RUO与cGMP的研发和制造衔接

MSC工艺可比性不仅取决于生物反应器，还与培养基、起始细胞材料及其他制造原料有关。如果不同开发阶段采用完全不同的培养基体系，即使设备构型相近，也可能因为营养和生长环境改变而影响细胞状态。

RoosterBio提供研究用途RUO及cGMP相关MSC培养材料，其公开技术资料介绍了不同等级产品在MSC扩增中的应用，并为部分cGMP相关原料提供美国FDA Type II Master File支持。

对于实际研究，需要将不同产品等级与其适用用途区分。即使相关RUO和cGMP培养材料具有相近的配方设计及技术路径，也不能在没有验证的情况下直接视为完全相同的原料；Master File支持也不等于监管机构已经批准使用该材料的所有最终细胞治疗产品。

原稿所整理的相关MSC及EV材料类别如下：

上述产品线分别涉及MSC扩增、EV收集及下游处理等不同工艺环节。对于MSC-EV研究，培养基选择不仅可能影响母细胞增殖，也可能影响后续EV收集，因此需要进一步分析母细胞质量与最终EV产品质量之间的关系。

相关RoosterBio MSC和细胞外囊泡工艺研究资料可作为了解这类制造体系的补充背景。具体研究仍需结合目标MSC来源、培养方式以及材料等级确定适用条件。

五、为什么RoosterBio的工艺设计能够在不同供体中保持相应表现

5.1 “不针对每个供体重新设计完整流程”的工艺思路

RoosterBio相关技术资料强调建立具有一定多供体适应性的基础培养流程，即先通过多个供体完成工艺开发与验证，再根据具体研究细胞的特点开展必要的参数调整。

这种工艺思路的意义，是希望减少每次更换供体以后都重新建立完整培养方案所带来的开发负担，并使不同供体的过程数据可以在相对一致的工艺框架中进行比较。

对于细胞治疗开发团队，一个稳定的基础工艺可以帮助提高实验设计和批次比较的效率，但不意味着只需要测试少量供体就一定能够满足全部临床开发要求。具体供体范围、代表性及相关质量评价仍需根据产品和研究阶段确定。

在实际开发过程中，早期研究可能使用特征较明确的细胞供体建立基础工艺，而后续研究阶段可能需要扩大供体范围，以评价制造方法面对不同生物学起始材料时的稳健性。

因此，统一基础流程与多供体验证应当相互结合，而不是把两者理解为可以相互替代的工作。

5.2 PDL终点与PDT比较的工程化保障

RoosterBio相关工艺思路强调，将累计PDL作为培养结束时的重要参考，并同时关注不同培养方式中的PDT及扩增过程表现。其目的是让细胞在相近累计扩增背景下进行质量比较，减少不同细胞培养历史对结果解释造成的影响。

原稿引用的具体研究数据中，部分2D与3D培养条件的PDT约为24小时，三维微载体培养研究还将最终PDL维持在16–20范围内。这些指标说明相应研究能够建立一定的生长控制基础。

但需要明确，PDT并不天然只由培养基配方决定，也可能受到供体、接种密度和培养环境等因素影响；PDL 16–20同样属于特定MSC来源和工艺条件下的研究结果，不应作为所有MSC产品通用的扩增终点。

因此，更完整的工程化保障并不只是规定相同PDL或PDT，而是将这些过程参数与细胞质量检测数据结合起来，观察实际工艺是否具有预期的重复性。

六、对治疗开发商的实施建议

基于RoosterBio相关公开研究和MSC规模化方法学，进行2D/3D培养工艺比较时，可以同时关注细胞累计扩增程度、身份表征、分化潜能、免疫调节能力、分泌谱以及与目标产品相关的效力指标。

其中PDL和PDT属于培养过程的重要记录信息，而CQA则用于进一步判断不同培养条件是否改变细胞的目标属性。两类数据需要相互支持，不能单独使用其中一种替代完整工艺可比性研究。

6.1 可比性研究的五维度比较框架

原稿根据相关研究和行业资料整理了细胞身份、分化潜能、免疫调节、分泌谱及体内效力五个维度，可作为设计MSC可比性研究时的分析参考。

需要说明，上述五个维度是一种可用于研究设计的综合框架，并不意味着每一篇被引用的研究都完整实施了所有五项检测。尤其涉及体内效力时，应根据目标产品的实际作用机制、研究阶段以及适用模型决定是否需要相关实验。

对于主要关注免疫调节作用的MSC产品，IDO等功能指标可能具有重要意义；对于关注分泌相关作用的研究，VEGF、IL-8、bFGF、HGF和TIMP等分泌谱可以提供补充信息。具体哪些指标应作为关键质量属性，仍需要根据目标细胞产品的功能和实际证据确定。

6.2 监管对接：可比性研究的边界

2026年Cell & Gene Live行业讨论中，Kiji Therapeutics的Miguel Forte等专家强调，分析可比性与临床可比性之间存在需要认真对待的边界。即使制造变化前后的细胞在多个实验室指标上具有相似性，也不一定能够直接证明其在具体临床应用中的表现完全相同。

因此，MSC工艺可比性研究不仅需要检查表面标志物和三系分化，也可能需要进一步分析免疫调节、分泌相关功能以及其他与目标产品预期作用机制有关的质量属性。

在监管研究和制造策略设计中，越接近临床开发的重要阶段，越需要充分评估较大工艺变更可能带来的影响。如果制造优化涉及培养模式、原料组成、收获或其他关键步骤变化，应结合相应数据确认是否需要新增质量或功能研究。

从这一角度看，RoosterBio相关PDL控制、多供体和不同规模的培养研究，为MSC制造可比性提供了技术参考，但并不能替代任何开发团队自身的产品表征、工艺验证及监管相关工作。

参考文献

[1] Cell & Gene Live. Scaling Next-Gen MSC Therapies Without Scaling Risk（网络研讨会，2026-09-10）。讲者：Michael Schuster（Mesoblast）、Edward Ahn（MEDIPOST）、Miguel Forte（Kiji Therapeutics）；主持：Erin Harris。

[2] Adlerz K, Takacs J, Kirian RD, Trempel M, Rowley JA, Ahsan T. A scalable and xeno-free bioreactor system for biomanufacturing of hUC-MSCs. Cytotherapy. 2020;22(5), Supplement:S46–S47.

[3] RoosterBio Blog. Advances in Clinical Translation & Scale-up of MSCs & Extracellular Vesicles at ISCT 2019.

[4] Lembong J, Kirian R, Takacs JD, Olsen TR, Lock LT, Rowley JA, Ahsan T. Bioreactor Parameters for Microcarrier-Based Human MSC Expansion under Xeno-Free Conditions in a Vertical-Wheel System. Bioengineering (Basel). 2020;7(3):73. DOI: 10.3390/bioengineering7030073.

[5] RoosterBio Blog. From Elephant Ears to Ambr Waves: A New Path Toward Scale & Abundance for Biomanufactured hMSCs & Their Exosomes.

[6] RoosterBio & Sartorius. Successful development of a scalable and robust process for MSC-EV production.

关于技术来源

本文基于RoosterBio公开的MSC培养研究、微载体扩增论文、会议研究资料及行业规模化讨论，曼博生物整理，仅用于科研信息分享及MSC 2D/3D工艺可比性研究参考。文中不同供体、PDL、PDT、反应器规模、细胞产量及CQA数据均对应特定来源与研究条件，不应直接推广为所有MSC工艺的固定结果。相关细胞培养工艺、MSC-EV生产及临床转化研究，仍需结合目标产品、细胞来源、质量属性和适用监管要求开展独立验证。