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摘要：本文基于Akron Bio封闭系统（CSS）液体细胞因子的制剂开发资料，介绍液体rHuIL-7与rHuIL-15的制剂筛选思路，比较三种缓冲体系与去污剂组合的初始稳定性，汇总2–8℃储存条件下IL-15 12个月、IL-7 9个月的理化与生物学活性数据，并比较液体CSS与冻干剂型在健康供者T细胞培养中的表现，为细胞治疗工艺中即用型细胞因子的剂型选择提供参考。

关键词：IL-7、IL-15、液体细胞因子、制剂开发、cGMP细胞因子、CAR-T、T细胞培养、NK细胞、液体制剂、冻干粉、制剂稳定性、Akron CSS

一、背景

细胞因子为T细胞的完整活化提供T细胞受体（TCR）与共刺激信号之外的第三类信号。IL-2、IL-7、IL-15等同属共用γ链（γc）细胞因子，能够参与T细胞的生长与扩增，因此在CAR-T及其他细胞治疗制造研究中具有重要应用背景。除了关注不同细胞因子的生物学作用，随着制造流程向封闭化与自动化发展，细胞因子的原料状态、剂型和加入方式也逐渐成为需要考虑的工艺变量。

Akron Bio自2006年起向细胞与基因治疗领域提供细胞因子、生长因子及人源血浆来源的培养基补充剂，相关产品应用于多个临床与商业化项目。对于自体细胞治疗工艺，细胞因子的单次使用量通常较小，传统操作经常需要将大规格冻干品复溶后再次分装。随着细胞治疗生产向单元操作封闭化、工艺自动化及生产去中心化发展，低剂量、单次使用、即用型的试剂形式受到关注，其目标是在操作便利性、工艺一致性与无菌操作要求之间取得平衡。

Akron Bio的Closed System Solutions（CSS）产品线面向细胞与基因治疗工艺中的封闭操作需求，覆盖人AB血清、人血清白蛋白（HSA）及重组人细胞因子等原料，其中rHuIL-2已有相关CSS液体剂型。对于IL-7和IL-15而言，将蛋白质从传统冻干形态转变为低浓度液体形态，需要解决长期储存过程中的聚集、表面吸附和氧化等稳定性问题，因此不能仅通过完成复溶和灌装就认为液体制剂开发已经完成。

本文介绍CSS rHuIL-7与rHuIL-15的制剂开发工作，比较用于稳定小规格袋装细胞因子的三种制剂，整理rHuIL-15 CSS 12个月、rHuIL-7 CSS 9个月的理化稳定性和生物学活性结果，并进一步介绍液体CSS剂型与传统冻干剂型在健康供者来源T细胞培养中的比较结果。各项观察均对应具体公开研究条件，不能直接代表其他配方或包装体系的固定性能。

二、材料与方法

所有制剂均使用符合cGMP相关要求的化学品制备。重组人IL-7与IL-15的生产和纯化，采用Akron市售rHuIL-7与rHuIL-15冻干产品常规使用的、经过验证的相关工艺，以保持制剂转换研究的原料基础相对一致。rHuIL-7与rHuIL-15 CSS液体研究样品灌装于Entegris Aramus 2D一次性袋组件中，用于开展相应长期稳定性评价。

蛋白质纯度使用反相高效液相色谱RP-HPLC与SDS-PAGE进行分析。IL-7和IL-15的浓度由RP-HPLC测定，研究通过对未氧化rHuIL-7或rHuIL-15对应色谱峰进行积分，计算相应蛋白浓度。因此，这一浓度结果与所采用的未氧化蛋白分析方法相关，需要与其他理化指标分开解释。

生物学活性测定中，rHuIL-7采用2E8细胞，rHuIL-15采用CTLL-2细胞。研究通过平行线浓度-反应模型，参照NIBSC参考标准估算相对效价，并依据USP 1032《生物测定的设计与开发》和USP 1034《生物测定的分析》相关原则处理生物学测定数据。通过结合色谱、电泳及细胞活性检测，研究不仅考察蛋白质的化学和物理状态，也进一步评价其在特定细胞功能测定中的活性保持情况。

三、制剂筛选与稳定性结果

（一）三种制剂的设计

为了将IL-15配制为0.01 mg/mL并评价初始稳定性，研究设计了三种制剂，重点比较不同缓冲体系、去污剂及抗氧化辅料的组合。三组制剂均使用相应IL-15原料，但其缓冲环境和辅料构成不同，以观察这些完整配方组合对低浓度液体蛋白稳定性的影响。

两种去污剂的选择基于其理化性质，以及理论上能够减少蛋白质聚集、降低蛋白质对一次性袋体的表面吸附并维持IL-15理化稳定性的预期。制剂II与制剂III中还加入筛选出的抗氧化辅料，用于评价相关配方对IL-15氧化变化的控制能力。由于不同制剂之间存在多个组成差异，初筛结果应首先用于比较完整配方，而不能直接确定单一辅料对全部稳定性变化的因果作用。

（二）制剂初筛结果

初筛以一个月为观察周期，分别在制剂配制后即刻和一个月时使用RP-HPLC测定CSS袋中的IL-15浓度与纯度。研究还提供不含IL-15的稀释液、IL-15标准品、未配制IL-15原液以及完整CSS制剂的色谱图，制剂I对应A至D、制剂II对应E至H、制剂III对应I至L，以观察不同样品之间色谱表现的差异。

结果显示，三种制剂经过一个月储存以后出现了不同变化。制剂I采用中性缓冲体系和去污剂1，不含抗氧化辅料，一个月后CSS袋内IL-15浓度从约6.0 μg/mL下降至约3.8 μg/mL，纯度从约87%下降至约73%，色谱图中还出现额外峰。制剂II采用酸性缓冲体系、去污剂2和抗氧化辅料，一个月时浓度约为9.0 μg/mL、纯度约83%。制剂III采用中性缓冲体系、去污剂2和抗氧化辅料，一个月时浓度约8.0 μg/mL、纯度约85%。

这些结果显示，中性缓冲体系与去污剂1组合的制剂I未能较好维持IL-15在袋内的稳定性，而含有去污剂2和抗氧化辅料的制剂II、III在短期观察中具有相对较好的结果，因此被选择进入后续长期稳定性研究。

（三）IL-15制剂II的12个月稳定性

研究将IL-15使用制剂II配制为0.01 mg/mL，每袋5 mL，灌装于20 mL CSS袋，并在2–8℃条件下储存12个月。研究期间通过电位法测定pH（A），使用RP-HPLC测定浓度与纯度（C、D），同时在不同时间点开展还原型SDS-PAGE分析（B），以综合评价蛋白质的理化变化。

结果显示，制剂II在12个月储存期间pH大致维持于6.3至6.5之间。SDS-PAGE纯度在所测时间点保持90%以上，大部分约95%至97%，第9个月未进行该项检测，第12个月约为96%。与此同时，RP-HPLC纯度由初期约85%缓慢下降至12个月时约65%；检测浓度在6.7至8.6 μg/mL之间波动，第12个月约为6.8 μg/mL。

研究资料将制剂II评价为具有较好的长期研究表现，但需要注意，其RP-HPLC纯度在12个月时已经明显低于初期结果，因此不能将相关数据概括为所有理化指标在储存期间均无变化。是否满足正式产品的质量接受标准，仍需要结合相应质量规格及完整稳定性方案判断。

（四）IL-15制剂III的12个月稳定性

研究进一步将IL-15使用制剂III配制为0.01 mg/mL，同样按每袋5 mL灌装于20 mL CSS袋，并在2–8℃条件下储存12个月。其pH、浓度、纯度及SDS-PAGE检测方法与制剂II相同，因此能够比较不同配方在相近实验条件下的稳定性表现。

结果显示，制剂III的pH保持在7.3至7.5之间，具有相对平稳的酸碱度变化，但蛋白质相关指标在储存后期下降更为明显。SDS-PAGE纯度在前6个月约96%至98%，第12个月下降至约76%；RP-HPLC纯度由约89%下降至约39%；浓度由约8.3 μg/mL逐渐下降至约3.6 μg/mL。

与制剂II相比，制剂III在12个月研究中的整体表现较差，尤其是蛋白质浓度和RP-HPLC纯度下降更加明显。因此，在所比较的完整配方中，含酸性缓冲体系的制剂II对IL-15表现出更适合继续研究的稳定性特点。

（五）IL-7制剂II的9个月稳定性

研究将IL-7使用制剂II配制为0.01 mg/mL，每袋10 mL，灌装于20 mL CSS袋，并在2–8℃条件下储存9个月。研究期间同样通过电位法测定pH（A），使用RP-HPLC测定浓度和纯度（C、D），并在不同时间点开展还原型SDS-PAGE分析（B）。

结果显示，IL-7制剂II的pH保持在约6.1，SDS-PAGE纯度约95%至96%，RP-HPLC纯度约98%至99%，第9个月时的检测浓度约7.4 μg/mL。整体来看，制剂II在该研究周期内维持了相对较好的纯度指标，同时仍需要单独记录实际可检测蛋白质浓度的变化。

（六）IL-7制剂III的9个月稳定性

研究将IL-7使用制剂III配制为0.01 mg/mL，每袋10 mL，灌装于20 mL CSS袋，在2–8℃条件下储存9个月，其分析方法与制剂II一致。

结果显示，IL-7制剂III的pH保持在约7.2，SDS-PAGE纯度约93%至94%，RP-HPLC纯度约96%至98%，第9个月时浓度下降至约3.8 μg/mL。与制剂II相比，两组在相应电泳与色谱检测中均能够保持较高的蛋白纯度，但制剂III在9个月时的蛋白浓度下降更加明显。

这说明两种制剂虽然在纯度指标方面都具有一定保持能力，但并不代表储存后的蛋白质含量完全相同。因此，在低浓度IL-7液体制剂研究中，需要同时观察纯度及浓度，而不能仅根据某一个百分比判断完整稳定性。

（七）生物学活性稳定性

在理化指标之外，研究进一步检测了IL-7与IL-15的生物学活性随储存时间的变化。rHuIL-7与rHuIL-15分别使用制剂II或制剂III配制为0.01 mg/mL，IL-7每袋10 mL，IL-15每袋5 mL，均使用20 mL CSS袋包装，在2–8℃条件下分别开展9个月和12个月的研究。图中的误差线表示各时间点测定结果的置信区间，用于辅助理解不同时间点效价的变化。

研究结果显示，IL-7制剂II与制剂III在9个月时每袋生物学活性均保持在10 MIU以上。对于IL-15，制剂II在12个月内每袋活性保持在约0.45至0.5 MIU范围，而制剂III在第9个月一度下降至约0.3 MIU，第12个月测得约0.4 MIU。相比之下，制剂II的活性保持曲线较为平稳。

生物学效价结果与理化检测共同说明，在所采用的特定研究条件下，液体IL-7和IL-15能够在相应储存时间后继续表现出可测活性。不过，生物学效价的保持并不能直接替代对色谱纯度、蛋白浓度和其他理化质量属性的评价，实际剂型稳定性仍需要多指标共同判断。

（八）与冻干剂型的T细胞功能比较

为了验证液体CSS剂型在实际使用中的表现，研究将其与冻干剂型在健康供者T细胞培养体系中进行比较。实验使用两名健康供者的冷冻单采血材料，经过复苏、分选和活化以后，分别在培养基中补充复溶的IL-7与IL-15冻干细胞因子，或者对应CSS液体制剂。IL-7、IL-15最终使用浓度分别为600 IU/mL和100 IU/mL，同时补充IL-2至100 IU/mL。

研究将配制好的培养基在2–8℃条件下保存，并于加入细胞因子后的第12天用于相应细胞培养。细胞收获时，检测CAR阳性细胞比例（A）以及CD4+/CD8+亚群比例（B）；同时将收获细胞冻存，以模拟细胞材料的储存过程，在数日后复苏检测细胞活率（C）。

结果显示，两种剂型对应的CAR阳性率接近，其中冻干组约47%，液体组约45%。同一健康供者在两种细胞因子剂型条件下获得的CD4+/CD8+亚群比例相似。冻存复苏后，CD4+细胞活率约97%至98%，CD8+细胞活率约84%至88%，液体组与冻干组的结果接近。

由此可见，在该研究使用的两名健康供者和特定培养体系中，培养基在2–8℃储存12天后，添加CSS液体细胞因子的T细胞在CAR阳性率、CD4+/CD8+亚群分布及冻存复苏活率方面，与使用复溶冻干细胞因子的相关结果相近。这为进一步评价液体CSS剂型在T细胞培养中的适用性提供了实验基础，但不能仅据此断言所有细胞治疗工艺中的两种剂型已经证明完全等效。

四、讨论

细胞因子参与T细胞活化与扩增的相关生物学机制已经获得较多研究，其在细胞治疗生产中的应用也较为普遍。随着制造流程逐渐向模块化、自动化以及更加灵活的生产形式发展，细胞因子等辅助原料的剂型和交付方式开始成为值得关注的技术问题。对于原本需要复溶和分装的冻干细胞因子，如果能够形成具有明确稳定性和生物学活性数据支持的液体剂型，就可以为封闭系统操作提供另一种选择。

本次制剂开发结果显示，rHuIL-7与rHuIL-15能够在研究所采用的配方和包装条件下，以低至10 μg/mL的浓度形成液体制剂，并分别在IL-7的9个月及IL-15的12个月研究周期中保持可测生物学活性。与此同时，部分理化指标也出现不同程度的变化，因此相关稳定性结果需要结合具体配方、分析方法和预设质量要求理解，长期稳定性研究及产品相关验证仍需持续开展。

制剂开发工作主要围绕低浓度细胞因子的缓冲体系与辅料组成展开。低浓度条件下，蛋白质可能更容易受到表面吸附及其他物理化学因素影响，氧化也属于蛋白质已知的化学降解途径之一[1][2][3]。通过比较不同缓冲液、去污剂及抗氧化辅料组合，研究观察到配方变化能够明显影响IL-15和IL-7在储存过程中的浓度、纯度与活性表现。

特别是对于IL-15，采用酸性缓冲体系、去污剂2及抗氧化辅料的制剂II，在所比较的完整配方中表现优于相应中性缓冲体系的制剂III。对于IL-7，制剂II和III的纯度结果均较高，但9个月时未氧化蛋白质浓度存在明显差异。这些数据共同说明，低浓度液体细胞因子不能仅通过单一pH、纯度或活性指标评价，而需要将多个质量属性共同纳入研究。

另一方面，液体CSS与冻干剂型在健康供者T细胞培养中的初步比较，显示两种剂型在所测CAR阳性率、CD4+/CD8+亚群组成和冻存复苏活率方面具有接近结果，为后续研究提供了相应参考。不过，相关比较的供者数量、细胞体系及评价终点均有明确范围，因此具体到其他细胞产品和制造工艺时，仍需要开展独立验证。

总体而言，本次研究为IL-7和IL-15液体细胞因子的配方筛选及封闭系统应用提供了技术数据，也说明从冻干向液体剂型转变并不只是减少一个复溶步骤，而是需要同时解决低浓度蛋白稳定性、包装系统适配、生物学效价和实际细胞培养功能等多个问题。

参考文献

[1] Ruiz L, et al. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 2005;8:207-216.

[2] Gitlin G, et al. Pharmaceutical Research. 1996;13:762-769.

[3] Torosantucci R, et al. Molecular Pharmaceutics. 2013;10:2311-2322.

关于技术来源

本文基于Akron Bio公开的液体IL-7、IL-15 CSS制剂开发资料及相关蛋白质稳定性研究文献，曼博生物整理，仅用于科研信息分享和实验技术参考。文中所列制剂组成、灌装条件、2–8℃储存、浓度、纯度、生物学活性以及健康供者T细胞比较结果均对应特定公开研究条件。实际实验和工艺应用仍需结合细胞类型、细胞因子使用浓度、培养基体系、包装形式及质量要求开展相应验证。
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