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AiCE 是一款基于蛋白质逆折叠（inverse folding）模型的高适配度（high-fitness, HF）突变预测工具。它把「结构约束」和「进化约束」融合进 AI 辅助的突变提名流程，帮助你从单点突变一路走到多突变组合设计，全程只需一条命令。本教程以仓库自带的 SpCas9 示例结构为例，手把手带你跑完 4 步流水线。

核心理念：先用 ProteinMPNN 等逆折叠模型「采样」出结构兼容的候选序列，再用LD 连锁不平衡矩阵与SCA 统计耦合分析矩阵双重打分，最终提名真正有潜力的 HF 突变。

一、认识 AiCE：为什么需要“结构 + 进化”双重约束

传统做法往往只看单一信号（如某个位点的共现频率），容易提名出看似合理、实际却相互拮抗的突变组合。AiCE 的出发点是让结构信息（逆折叠采样 + DSSP 二级结构）与进化信息（LD / SCA 耦合分析）协同工作，从而筛出更稳定、可实验验证的高适配度突变。

上图展示了蛋白质结构上的进化扇区（IC1–IC4）分布，SCA 正是用来量化这些区域间残基的进化耦合关系。

二、安装环境：一次配好四步流水线

四步流程依赖若干外部组件，建议一次配齐，避免中途报错：

• Python ≥ 3.8+ PyTorch、NumPy、SciPy、Pandas、Biopython、ProDy
• mkdssp（DSSP 二级结构，v4.4.7）
• plink（LD 计算，v1.9.0，注意 v2.0 默认不兼容）
• ProteinMPNN（逆折叠，仓库已内置于 scripts/ProteinMPNN/）
• pySCA（SCA 分析，已内置于 scripts/pySCA/）

依赖可直接用 requirements.txt 一键安装：

conda create -n AiCE python=3.11 conda activate AiCE pip3 install -r requirements.txt

💡 若你的结构是.cif格式，先用 scripts/cif2pdb.py 转成.pdb再开始。

三、第 1 步：单点高适配度突变提名

进入示例目录，把结构文件（example/SpCas9_af3.pdb）所在文件夹作为输入：

cd example/ bash ../scripts/01.single_mut_prediction.sh ../scripts ./ 0.8 0.5

脚本 scripts/01.single_mut_prediction.sh 会依次完成四件事：

1. 调用 scripts/inverse_MPNN.sh 用 ProteinMPNN 采样出 1000 条结构兼容序列（num_seq_per_target=1000、sampling_temp=0.5）；
2. 用 awk 规整 FASTA 表头（首条为>ref）；
3. 跑 DSSP 二级结构、统计各残基出现频率；
4. 按β（非卷曲区阈值）与γ（卷曲区阈值）两档阈值筛选出单点 HF 突变，推荐通用值0.8 / 0.5。

🎯 不确定阈值？可用自动推荐脚本 scripts/01.single_mut_Auto_prediction.sh，它会根据输入结构自动推断 β / γ。

这一步的关键输出（以示例 SpCas9_af3 为例）：

其中.mut文件就是单点提名结果，每行形如4 K P 0.8942 C（位置 4，K→P，频率 0.89，处于卷曲区）。

四、第 2 步：构建 LD 连锁不平衡矩阵

LD 矩阵刻画不同位点变异的共现强度，是后续多突变组合打分的依据。脚本 scripts/02.caculated_ld.py 会自动把蛋白 MSA「伪反向翻译」成 DNA，再借 plink 计算连锁不平衡：

python ../scripts/02.caculated_ld.py ../output/ ../output

产出两个文件：

• SpCas9_af3.ld：LD 连锁不平衡矩阵；
• SpCas9_af3.vcf：记录突变信息的 VCF 文件。

五、第 3 步：构建 SCA 统计耦合分析矩阵

SCA（Statistical Coupling Analysis）用于量化残基间的进化耦合效应。这一步由 scripts/03.caculated_sca.sh 调用内置的 scripts/pySCA/scaProcessMSA.py 与 scripts/pySCA/scaCore.py 完成：

bash ../scripts/03.caculated_sca.sh ../scripts/pySCA/ ../output ../output

SCA 把结构中的进化耦合「拆解」成若干相互正交的子成分（IC），直观展示了耦合信号如何在蛋白内部分布：

上图为 SCA 的扇区分解结果：左侧是完整扇区，右侧 IC1–IC6 依次是分解出的正交耦合成分。

运行结束后会得到：

• SpCas9_af3.sca_matrix.tsv：氨基酸进化耦合矩阵；
• SpCas9_af3.db：中间二进制文件。

耦合矩阵通常以热力图呈现，颜色越「热」代表两个残基的进化耦合越强：

六、第 4 步：多突变组合提名

最后一步把 LD 与 SCA 两套矩阵结合，对突变组合打分。脚本 scripts/04.com_mut_prediction.sh 会自动查找.fa / .sca_matrix.tsv / .ld / .comb / .vcf并调用 scripts/com_mut_prediction.py：

bash ../scripts/04.com_mut_prediction.sh ../scripts ../output/ 2 ../output

参数2表示「遍历所有双突变组合」；也可传一个位置列表（如1 3 5）只对指定组合打分。

输出为两类结果文件，每行格式为：

突变类型 平均成对分数 对数平均成对分数 逻辑标志(0/1)

第四列是推荐标志（1 推荐 / 0 不推荐），默认阈值为 LD 0.5、SCA 90 分位；可通过-t参数自定义。分别写入SpCas9_af3.sca.result与SpCas9_af3.ld.result。

七、输出速查表

八、小贴士与常见问题

• ⚠️务必用bash而非sh执行脚本，否则会报出无关错误。
• 📁 所有脚本都使用相对路径，请按你的目录结构调整参数。
• 🧬 想更换逆折叠模型（LigandMPNN、ESM-IF1、SaProt 等）？核心思路一致，可替换 scripts/inverse_MPNN.sh 中的调用即可。
• 🧪 需要快速上手？可直接打开交互示例 AiCE_demo.ipynb，或在 README.md 查看完整说明。
• 💡 官方对多突变组合效果持「谨慎而积极」的态度，正持续迭代升级版以提升组合设计的稳定性，结果建议结合湿实验验证。

跑完这 4 步，你就拥有了一套从单点到多突变、兼顾结构 + 进化约束的高适配度突变提名方案——这正是 AiCE 的核心价值。