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生物大分子批量仿真开发教程（14）：可开发性批量评估（二）——聚集、稳定性与免疫原性，多源分数合成统一风险表

版本声明块

• 工具/软件：TANGO（tango.crg.es）；AGGRESCAN→Aggrescan3D（A3D2）/Aggrescan4D（A4D）；CamSol/CamSol3.0；TAP；BioLuminate（SAP 商业实现）；NetMHCIIpan-4.0；TepiTool（IEDB）
• 语言/环境：Python 3.10 + pandas；服务器状态实测日期2026-09-04
• 本文目标：给第 13 篇的可开发性矩阵补上"聚集、稳定性、免疫原性"三条腿，合成一张多源统一风险表

一句话结论：本篇的硬事实是服务器现状（实测 2026-09-04，铁律 8）：TANGO 在线（https://tango.crg.es/）但需注册许可；AGGRESCAN 原站（bioinf.uab.es）已失效、后继 A3D2（http://biocomp.chem.uw.edu.pl/A3D2/）与 pH 依赖的 A4D（https://biocomp.chem.uw.edu.pl/a4d/）在线；CamSol 原剑桥服务器为维护页、只能本地安装；Zyggregator 无维护入口；SAP 的商业实现只在 BioLuminate——所以批量流水线必须带"可用性探针 + 替代路径"，再把 TANGO/A3D/CamSol/TAP 分数、第 12 篇 MD 代理量与 NetMHCIIpan-4.0/TepiTool 免疫原性分按"批次内百分位 + 一票否决 + 计数投票"聚合成统一风险表，用 AC-SINS（Liu 2014 mAbs，Δλmax）等实验批次回归校准阈值。

〇、本篇要解决的认知问题

1. 聚集预测工具谱系到 2026 年 9 月还能用哪些？TANGO、AGGRESCAN、A3D/A4D、CamSol、Zyggregator、SAP 各自的现状与替代路径是什么？
2. 序列级聚集热点（TANGO/AGGRESCAN 系）与结构级聚集倾向（A3D/SFvCSP/SAP）在方法论上差在哪，为什么两条都要？
3. Tagg、Tm 这些实验热稳定量，在 MD 侧有什么可用的代理量？"代理"二字边界在哪？
4. 免疫原性批量预测怎么做？NetMHCIIpan-4.0 与 TepiTool 各占什么位置，局限是什么？
5. 多源分数（量纲、方向、缺失率全不同）怎么合成一张可审计的统一风险表，实验对照（AC-SINS/HIC/BVP-ELISA）怎么进来校准？

一、机制解析

1.1 聚集工具谱系与实测现状（2026-09-04，铁律 8）

引用在线工具不给实测日期等于埋雷。以下为系列基线日期的登记结果，流水线代码必须内嵌同一张表（见 2.1）：

三条工程教训：URL 是配置不是常量（迁址=改配置文件，脚本不动）；许可状态进风险登记表（TANGO 的注册许可意味着自动化提交要过合规，不能偷偷爬）；"原站 404"是所有在线工具工具的默认预期——探针先行、失败降级到本地实现，是流水线的常态分支而不是异常。

1.2 序列级 vs 结构级：遮蔽机制是全部差异的来源

同一句序列，TANGO/AGGRESCAN/CamSol 看到的是"氨基酸内在倾向"；A3D/SAP/SFvCSP 看到的是"折叠后还剩多少暴露在表面"。一个埋在上表面的聚集六肽，序列级打高分、结构级接近零；一个界面残基在单体里埋藏、在二聚过渡态暴露——于是两层的分歧本身就是信号：序列高分 + 结构低分 ≈ 可控；两边都高 = 真热点；序列低 + 结构高（罕见，多为构象特异斑块）→ 交给第 12 篇 MD 看构象系综会不会路过它。统一风险表因此三层并列，而不是只取其一。

1.3 Tagg/Tm 与 MD 代理量

实验侧的地面真值：Tm（熔解温度，DSC/nanoDSF）与Tagg（聚集起始温度， nanoDSF 背散射通道）；色谱面板 HIC/SEC/CEX-IEX/SMAC 补疏水/体积/电荷维度。批量不可能全量做实验，MD 侧可用的代理量（经验法则，不是铁律，且各家 SOP 阈值不同）：第 12 篇输出的rmsd_last（构象稳定）、rg_drift（展开趋势）、sb_occ（盐桥网络完整度），加上"斑块面积在系综内的 P95 分位"（把第 13 篇结构级指标从单构象扩展成构象分布）。代理量与 Tagg/Tm 的关系是排序近似：它们大概率能把"最不稳的 5%“捞出来，不能预测"Tagg=68.4 ℃”。风险表把 MD 代理列的置信度标为"低/样本少"正是为此。

1.4 免疫原性：MHC-II 呈递预测的两个层次

T 细胞依赖的免疫原性主流 in silico 路径是肽段-MHC-II 结合预测：

• NetMHCIIpan-4.0（Reynisson 2020 J Proteome Res，DOI 10.1021/acs.jproteome.9b00874）：单一 HLA-DR 等位基因的精配模型，实测 2026-09-04 在线（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHCIIpan-4.0/），DTU 规则要求非商用/学术用途合规；
• TepiTool（Paul 2016 Curr Protoc Immunol，DOI 10.1002/cpim.12，http://tools.iedb.org/tepitool/）：把多等位基因、多类 I/II 分子结果聚合成 population consensus 百分位的流水线——批量选人群覆盖度用 TepiTool 的 consensus，单基因高置信复评用 NetMHCIIpan-4.0，二者是互补而非替代。

局限必须写进报告：呈递 ≠ 实际 T 细胞应答（链接表位显性、竞争、加工都不在模型内），所以免疫原性列只做"相对排序 + 高风险标记"，进风险表的权重低于聚集类指标（示例权重见 2.2 配置）。

1.5 实验对照锚点

计算排序不可自证，需要实验批次回归：AC-SINS（亲和力捕获自相互作用纳米颗粒光谱，读出 Δλmax 红移；Liu 2014 mAbs 6:483，DOI 10.4161/mabs.27431）做自相互作用的批量金标准旁证；HIC（疏水作用色谱保留时间）对斑块/疏水列；BVP-ELISA（生物素化 VP 抗原池）与表面等离子共振对多反应性（polyreactivity，锚文献 Jain 2017 PNAS 114:944，DOI 本轮未复核、正式引用前以出版方页面为准）。校准方法：攒一批 ≥30 个有实测值的变体，算风险表综合分与 Δλmax 的 Spearman 相关，阈值随相关结构调——不校准的阈值是装饰。

二、完整代码与逐行剖析

2.1 服务器可用性探针：probe.py（把铁律 8 变成每次运行的例行动作）

#!/usr/bin/env python# -*- coding: utf-8 -*-"""probe.py —— 上线前先问"工具还活着吗"，状态写进风险表元数据（不是写进人的记忆）"""importdatetimeimporturllib.requestimportpandasaspd SERVERS={# URL 全部来自本系列素材登记表；改址=改这张配置表"TANGO":"https://tango.crg.es/",# 在线但需注册许可"A3D2":"http://biocomp.chem.uw.edu.pl/A3D2/",# AGGRESCAN 后继"A4D":"https://biocomp.chem.uw.edu.pl/a4d/",# pH 依赖版"NetMHCIIpan":"https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHCIIpan-4.0/","TepiTool":"http://tools.iedb.org/tepitool/","AGGRESCAN_old":"http://bioinf.uab.es/",# 原站域名（素材核实其已失效）：}# 预期不可达，留作回归对照# CamSol 原剑桥服务器（mvsoftware 系）实测为维护页，但其原始 URL 未在本系列素材中逐字核实，# 故不进探针表——这正是"探针清单=已核实登记表"的纪律：宁缺毋假。生产路径=本地安装。defprobe(url:str,timeout:float=15.0)->dict:req=urllib.request.Request(url,headers={"User-Agent":"devrisk-probe/1.0"})# 带 UA 是公共服务器的基本礼貌：部分站点把无 UA 请求直接 403，会造成"假下线"误判try:withurllib.request.urlopen(req,timeout=timeout)asr:# 只 GET 首页：探针不做提交，return{"url":url,"ok":True,"status":r.status}# 避免对限速服务造成负担exceptExceptionase:return{"url":url,"ok":False,"status":type(e).__name__}# 异常类型入库：# 区分 404/超时/TLS 三种死法defmain()->None:today=datetime.date.today().isoformat()df=pd.DataFrame([{"checked_on":today,**probe(u)}foruinSERVERS.values()])df["note"]=df.url.map(lambdau:{SERVERS["TANGO"]:"需注册许可后自动化提交",SERVERS["AGGRESCAN_old"]:"已知失效→用 A3D2"}.get(u,""))df.to_csv(f"server_status_{today}.csv",index=False)print(df.to_string(index=False))if__name__=="__main__":main()# 基线预期（2026-09-04 实测口径）：TANGO/A3D2/A4D/NetMHCIIpan/TepiTool 可达；# AGGRESCAN_old 不可达——探针输出与预期不符时先修流水线，再谈跑分

2.2 统一风险表聚合器：risk_table.py

#!/usr/bin/env python# -*- coding: utf-8 -*-"""risk_table.py —— 第 13 篇矩阵 + 聚集/免疫原性列 + MD 代理列 → 统一风险表（含实验回归）"""importpandasaspd METRICS=[# 每列登记：方向、权重、层级、置信度 —— 元数据行而非裸列名，是审计的最小代价{"col":"TANGO_score","lower_better":True,"w":1.0,"layer":"seq","conf":0.8},{"col":"A3D_score","lower_better":True,"w":1.0,"layer":"struct","conf":0.8},{"col":"CamSol_score","lower_better":False,"w":1.0,"layer":"seq","conf":0.8},{"col":"FvCSP","lower_better":True,"w":0.8,"layer":"seq","conf":0.9},{"col":"SFvCSP","lower_better":True,"w":0.8,"layer":"struct","conf":0.9},{"col":"md_rmsd_last","lower_better":True,"w":0.5,"layer":"md","conf":0.4},{"col":"imm_pct","lower_better":False,"w":0.4,"layer":"immuno","conf":0.5},]VETO_Q=0.02# 一票否决线：任一指标批次内最差 2%（第 13 篇 1.4 同款规则，跨篇同构）PASS_Q=0.50# 计数投票线EXPERIMENT={# 有实测批次时启用回归校准；键=实验名，值=对应"应该相关的计算列""AC-SINS_dlambda_max":"A3D_score",# Δλmax（Liu 2014）对结构级聚集列"HIC_retention":"CamSol_score",}defpct(s:pd.Series,lower_better:bool)->pd.Series:r=s.rank(pct=True)# 百分位只在提交批次内做：跨批次绝对分不可比（第 13 篇returnriflower_betterelse1-r# 3.3 的同款坑）；方向统一成"越大越安全"再进合成defmain(dev_csv:str,md_csv:str,imm_csv:str,out:str)->None:df=pd.read_csv(dev_csv).set_index("variant")# 第 13 篇 A/B/C/D 分层表进这里df=df.join(pd.read_csv(md_csv).set_index("job").rename(columns={"rmsd_last":"md_rmsd_last"}),how="left")df=df.join(pd.read_csv(imm_csv).set_index("variant"),how="left")# imm_pct：TepiTool# ↑ join 不上=该变体没跑 MD/免疫评，列留 NaN——"缺测"和"测了很差"在风险表里必须可区分（铁律 10）cols=[mforminMETRICSifm["col"]indf.columns]# 列白名单交集：上游加列不污染投票df["n_metrics"]=df[[m["col"]formincols]].notna().sum(1)df["veto"]=Falseweighted,voted=pd.Series(0.0,index=df.index),pd.Series(0,index=df.index)formincols:r=pct(df[m["col"]].astype(float),m["lower_better"])# NaN 保持 NaN，不补 0：veto_part=(r<VETO_Q).fillna(False)# 把缺测当差=冤枉，当好=漏判df["veto"]|=veto_part# 缺测变体进复核队列而不是投票池voted+=(r>PASS_Q).fillna(False).astype(int)weighted+=r.fillna(0.5)*m["w"]*m["conf"]# 缺列按中性 0.5+降权是df["risk_score"]=weighted/sum(m["w"]*m["conf"]formincols)# 保守选择，须与 n_metrics 同读df["votes_pass"]=voted df["risk_tier"]="D"df.loc[~df["veto"],"risk_tier"]="C"df.loc[(~df["veto"])&(df["votes_pass"]>=5),"risk_tier"]="B"df.loc[(~df["veto"])&(df["votes_pass"]>=6)&(df["n_metrics"]>=len(cols)),"risk_tier"]="A"forexp_col,calc_colinEXPERIMENT.items():# 有实测列时做排序一致性校准：ifexp_colindf.columns:# Spearman 手写免依赖two=df[[exp_col,calc_col]].dropna()iflen(two)>=10:# n<10 的相关是噪声，直接跳过a=two[exp_col].rank();b=two[calc_col].rank()rho=((a-a.mean())*(b-b.mean())).sum()/(((a-a.mean())**2).sum().sqrt()*((b-b.mean())**2).sum().sqrt())df.attrs[f"spearman_{exp_col}"]=round(float(rho),3)# ρ 写进表元数据，# 报告页引用它；|ρ| 不达标（经验线 <0.5）就先调权重再扩大候选池——顺序不能反df.to_csv(out)print(df["risk_tier"].value_counts())print("缺测复核队列：",df[(df["n_metrics"]<len(cols))&(df["risk_tier"]!="D")].shape[0])if__name__=="__main__":main("dev_matrix_voted.csv","md_metrics.csv","immunogenicity.csv","risk_table.csv")

（imm_pct的生成：把每个变体 Fv+Fc 序列切成 15-mer 肽池（窗口/步长为可配置项），逐肽送 NetMHCIIpan-4.0 或本地版，再按 TepiTool 思路聚合人群覆盖百分位——服务的输入输出文件格式以其页面与安装版 --help 为准，本文不臆造字段名；肽切分就是row[i:i+15]的滑窗，属于第 02 篇级别的基础操作。）

2.3 免疫原性肽池生成 + 提交护栏：peptides.py

#!/usr/bin/env python# -*- coding: utf-8 -*-"""peptides.py —— 序列→15-mer 肽池（NetMHCIIpan/TepiTool 通用输入形态），带提交护栏"""frompathlibimportPathimportpandasaspddefmake_peptide_pool(seq:str,length:int=15,step:int=1)->list:return[seq[i:i+length]foriinrange(0,len(seq)-length+1,step)]# 15-mer 是 MHC-II 结合预测的通用肽长惯例；step=1 全覆盖但提交量 = 序列长，批量前先想清楚defmain(csv_in:str,csv_out:str,chunk:int=5000)->None:df=pd.read_csv(csv_in)withopen(csv_out,"w",encoding="utf-8")asfh:for_,rindf.iterrows():pep=make_peptide_pool(str(r["full_sequence"]))forkinrange(0,len(pep),chunk):# 分块文件：Web 服务都有单次/每日限额，part=f"{csv_out}.part{k//chunk}"# 分块=失败只重传一块（幂等思路同铁律 5）withopen(part,"w",encoding="utf-8")aspf:forpinpep[k:k+chunk]:pf.write(f"{r['variant']}|{k}\t{p}\n")# 行首回标 variant：结果回流时# 肽→变体的归属链必须在生成时就写死，事后按序列反查会被重复肽咬死print("peptide chunks written for",len(df),"variants")if__name__=="__main__":main("dev_matrix_voted.csv","peptides.tsv")

三、常见报错与排查

1. 脚本上周还能连 AGGRESCAN，今天全批 404。现象即铁律 8 的现实版。根因：原站失效不是故障而是终态。解法：跑 2.1 探针→按登记表切 A3D2 路径→对历史批次标注数据源版本；把"探针失败=流水线自动降级"写进编排（第 19 篇的重试分类）。
2. TANGO 结果迟迟拿不到/账号被限。根因：服务器在线但需注册许可（2026-09-04 实测），且自动化爬取违反使用条款。解法：走注册与批量接口谈判；流水线里 TANGO 列允许缺测（2.2 已按缺测中性化处理），主投票不依赖单源。
3. 风险表里最差档全是"没跑过 MD 的变体"。根因：把缺测按 0 分处理。解法：按 2.2 的纪律——缺列不投票、n_metrics与risk_score永远同读；缺测变体进复核队列而非淘汰队列。
4. 免疫原性两列互相矛盾（NetMHCIIpan 低危、TepiTool consensus 高危）。根因：单等位基因模型 vs 人群覆盖百分位是两个问题。解法：报告里分开陈述——“DRB1*04:01 呈递风险低，但人群覆盖后的 consensus 偏高（多等位基因贡献）”；权重设置（2.2 里 imm 0.4×conf 0.5）已经体现"免疫列只做标记不做主刀"。
5. pH 换了，A3D 分数不动、A4D 动了，风险表结论打架。根因：不同 pH 敏感度来自工具方法本身。解法：制剂 pH 敏感候选一律以 A4D/CamSol3.0（pH 版）为准，把 pH 写进列名（A4D_score_pH5.2风格），风险表按"配方 pH 匹配列"取数。

四、动手练习

1. 探针回归（可判定）：运行 2.1，与基线预期比对。判定标准：7 个 URL 全部有ok/status字段；TANGO/A3D2/A4D/NetMHCIIpan/TepiTool 可达，AGGRESCAN_old/CamSol_old 不可达——任何一格与预期不符，先查网络出口再查工具。
2. 风险表完整性（可判定）：用 100 变体（含 15 个缺 CamSol、10 个缺 MD 列）跑 2.2。判定标准：A 层变体n_metrics必须等于指标总数（A 层不允许缺测）；25 个缺测变体不得出现 veto=True（缺测≠差）。
3. 实验校准（可判定）：取 ≥30 个有 AC-SINS Δλmax 实测的变体回灌EXPERIMENT。判定标准：spearman_AC-SINS元数据被写出；若 |ρ|<0.3，把 A3D 权重降半并记录调权日志——调权必须留痕，这是对外报告的可信度底线。

五、小结与下一篇预告

本篇补齐了统一风险表的三条腿：聚集（TANGO/A3D/A4D/CamSol/SAP 谱系 + 2026-09-04 实测现状表）、稳定性（Tagg/Tm 地面真值与 MD 代理量的"排序近似"边界）、免疫原性（NetMHCIIpan-4.0 精配 + TepiTool 人群共识），并把第 13 篇的投票规则跨篇同构地延伸到多源分数合成——方向归一、批次内百分位、缺测中性化、一票否决、实验回归校准五步，一步都不能省。双抗与 ADC 在这张表之上还有专属的界面与偶联风险，第 15 篇《双抗与 ADC 的专项仿真》处理它们；万条序列的漏斗预算与断点续跑在第 17 篇实战中验收，第 18 篇把本篇风险表直接装进双抗流水线。

本篇认知问题回显（FAQ）

Q1：2026-09-04 实测下，各聚集预测服务器现状如何，替代路径是什么？
A：TANGO（tango.crg.es）在线但需注册许可；AGGRESCAN 原站 bioinf.uab.es 失效、CSIC 镜像 404；后继 A3D2（biocomp.chem.uw.edu.pl/A3D2/）与 pH 依赖的 A4D（biocomp.chem.uw.edu.pl/a4d/）在线；CamSol 原剑桥服务器为维护页→只能本地安装；Zyggregator 无维护入口仅作历史对比；SAP 商业实现在 BioLuminate，开源近似为 TAP 的 SFvCSP + A3D。

Q2：序列级和结构级聚集预测差在哪，为什么都要跑？
A：序列级（TANGO/AGGRESCAN 系/CamSol）量氨基酸内在倾向，结构级（A3D/A4D/SAP/SFvCSP）量折叠后的表面暴露——差异来源是"埋藏遮蔽"。两层分歧本身就是信号：双高=真热点，序列高结构低=可控，序列低结构高=构象特异，交 MD 构象系综复核。

Q3：Tagg/Tm 与 MD 代理量是什么关系？
A：Tm（DSC/nanoDSF 熔解温度）与 Tagg（nanoDSF 背散射聚集起始温度）是实验地面真值；MD 代理量用轨迹分析指标 rmsd_last、rg_drift、盐桥占用率及斑块面积的系综 P95，只能做"最不稳 5% 排序"的近似，不能预测绝对温度值——风险表里该层置信度权重最低（示例 0.5×0.4）。

Q4：NetMHCIIpan-4.0 和 TepiTool 在批量免疫原性里各干什么？
A：NetMHCIIpan-4.0（Reynisson 2020，实测 2026-09-04 在线于 DTU 服务站）做单一 HLA-DR 等位基因的精配结合预测；TepiTool（Paul 2016，tools.iedb.org/tepitool）把多等位基因/类别结果聚成人群覆盖 consensus 百分位。批量用 consensus 保覆盖度，重点分子用前者复评；呈递≠应答，免疫列只做标记（权重 0.4、置信 0.5）。

Q5：多源分数怎么合成统一风险表，实验对照怎么用？
A：五步——方向归一（越安全越大）、批次内百分位（跨批不可比）、缺测中性化 0.5 并单独记 n_metrics、一票否决 + 计数投票出 A/B/C/D 层、有 AC-SINS/HIC 实测列时对相应计算列做 Spearman 排序一致性校准（n≥10 才做，|ρ|<0.5 先调权重再扩池，调权留痕）。